乙醇脫氫酶（Alcohol Dehydrogenase，ADH）活性測定試劑盒

商品貨號：QS1007
英文名稱：Alcohol Dehydrogenase (ADH) Assay Kit
別名：乙醇脫氫酶試劑盒 ADH Kit 乙醇脫氫酶（ADH）試劑盒
檢測方法：常量法

測定意義：

ADH是生物體內(nèi)短鏈醇代謝的關(guān)鍵酶，催化乙醇與乙醛可逆轉(zhuǎn)換，在很多生理過程中起著重要作用。哺乳動物ADH主要在肝臟生成，肝臟損傷導(dǎo)致ADH釋放到血清中。血清ADH活性高低反映了肝功能是否異常。

測定原理：

ADH催化NADH還原乙醛生成乙醇和NAD+，NADH在340nm處有吸收峰，而NAD+沒有；測定340nm 吸光度下降速率，來計算ADH活性。

貨號: QS1007                                             規(guī)格：50管/48樣

乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）活性測定試劑盒說明書

紫外分光光度法

注意：正式測定之前選擇 2-3 個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義：

ADH是生物體內(nèi)短鏈醇代謝的關(guān)鍵酶，催化乙醇與乙醛可逆轉(zhuǎn)換，在很多生理過程中起著重要作用。哺乳動物ADH主要在肝臟生成，肝臟損傷導(dǎo)致ADH釋放到血清中。血清ADH活性高低反映了肝功能是否異常。

測定原理：

ADH催化NADH還原乙醛生成乙醇和NAD⁺，NADH在340nm處有吸收峰，而NAD⁺沒有；測定340nm 吸光度下降速率，來計算ADH活性。

自備實驗用品及儀器：

研缽、冰、低溫離心機、紫外分光光度計、1mL石英比色皿、可調(diào)式移液器和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體×1瓶，室溫保存。

試劑二：液體×1瓶，4℃保存。臨用前把試劑三轉(zhuǎn)移到試劑二中，4℃保存。                 

試劑三：粉劑×1支，－20℃保存。

試劑四：液體×1瓶，4℃保存。

粗酶液提取：

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿。16000g，4℃離心20min，取上清置冰上待測。
2. 細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；16000g， 4℃離心20min，取上清液置冰上待測。

3、血清等液體：直接測定。

ADH測定操作：

1. 分光光度計預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長到340 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑二在25℃水浴中保溫30 min。

3. 空白管：在1mL石英比色皿中依次加入100μL蒸餾水、800μL試劑二和100μL試劑四，迅速混勻后于340nm測定吸光值變化，分別記錄15s和75s時吸光值，分別記為A1和A2?！鰽空白管=A1-A2。。

4. 測定管：在1mL石英比色皿中依次加入100μL上清液、800μL試劑二和100μL試劑四，迅速混勻后于340nm測定吸光值變化，分別記錄15s和75s時吸光值，分別記為A3和A4?！鰽測定管=A3-A4。

注意：空白管只需測定一次。

計算公式：

（1）按照蛋白濃度計算

活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1μmol NADH 為1個酶活單位。

ADH (μmol/min/mg prot) =[(△A測定管–△A空白管)÷ε÷d×V反總×10⁶] ÷(Cpr×V樣)÷T

=1.61×(△A測定管–△A空白管) ÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計算

活性單位定義：25℃中每克組織每分鐘氧化1μmol NADH 為1個酶活單位。

ADH (μmol/min/g鮮重) =[(△A測定管–△A空白管)÷ε÷d×V反總×10⁶] ÷(W×V樣÷V樣總)÷T

=1.61×(△A測定管–△A空白管) ÷W

（3）按細(xì)胞數(shù)量計算

活性單位定義：25℃中每10⁴個細(xì)胞每分鐘氧化1μmol NADH 為1個酶活單位。

ADH (μmol/min/10⁴cell) = [(△A測定管–△A空白管)÷ε÷d×V反總×10⁶] ÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T

=1.61×(△A測定管–△A空白管) ÷細(xì)胞數(shù)量

（4）按液體體積計算

活性單位定義：25℃中每毫升血清每分鐘氧化1μmol NADH 為1個酶活單位。

ADH (μmol/min/mL) = [(△A測定管–△A空白管)÷ε÷d×V反總×10⁶] ÷V樣÷T

=1.61×(△A測定管–△A空白管)

ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光徑，1 cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，1000μL=0.001 L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，100μL=0.1 mL；T：反應(yīng)時間，1min。

注意事項：

1. 上清液蛋白質(zhì)濃度需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。
2. 配制好的試劑二3天使用完。