蛋白電泳 SDS-PAGE及WESTERN BLOT
蛋白電泳 SDS-PAGE原理
SDS是一種陰離子表面活性劑，能打斷蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵，并按一定的比例和蛋白質(zhì)分子結(jié)合成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其本身原有的電荷，掩蓋了各種蛋白分子間天然的電荷差異。因此，各種蛋白質(zhì)-SDS 復(fù)合物在電泳時(shí)的遷移率，不再受原有電荷和分子形狀的影響，而只是棒長的函數(shù)。這種電泳方法稱為SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（簡稱SDS—PAGE）。實(shí)驗(yàn)使用過程中，還加入DTT或者巰基乙醇，以打開蛋白間的二硫鍵，破壞蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)。SDS—PAGE常采用垂直板不連續(xù)系統(tǒng)（分離膠與濃縮膠）。
一、樣品制備
本公司有多種用于樣品制備的組織裂解液，每款裂解液會(huì)配備一管蛋白酶抑制劑pmsf。本公司還有多種蛋白酶抑制劑供您使用。
- 實(shí)驗(yàn)試劑
- 蛋白提取
- 蛋白定量
| 產(chǎn)品貨號(hào) | 產(chǎn)品名稱 |
|---|---|
| R0010 | RIPA_ |
| R0020 | 普通RIPA |
| R0030 | 非變性組織細(xì)胞裂解液 |
| A8260 | Aprotinin 蛋白酶抑制劑（抑肽酶） |
| P8100 | Pepstatin A 胃蛋白酶抑制劑 |
| P1260 | (All-in-one,100x)蛋白磷酸酶抑制劑混合物 |
| T8031 | Trypsin inhibitor 胰蛋白酶抑制劑 |
| P1260 | (All-in-one,100x)蛋白磷酸酶抑制劑混合物 |
| 539133 | Protease Inhibitor Cocktail Set VI |
| 539134 | Protease Inhibitor Cocktail Set III |
| PC0030 | Lowry法蛋白濃度測定試劑盒 |
| PC0010 | Bradford蛋白濃度測定試劑盒> |
| PC0020 | BCA蛋白濃度測定試劑盒 |
二、蛋白電泳
- 實(shí)驗(yàn)試劑
- 預(yù)制膠
- 制膠
- 上樣及電泳
- 染色
SDS-PAGE如今已形成成熟的方案，實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)自己的情況和習(xí)慣來選擇試劑。如選擇1、2、3、4、5、6、7、8、9全部試劑可自己配制。也可以選擇配制好的試劑。如10、11、12、13/14、16、9、20。還可選擇10、13/14、16、9、17、18、19、20。
| 系號(hào) | 產(chǎn)品貨號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 系號(hào) | 產(chǎn)品貨號(hào) | 產(chǎn)品名稱 |
|---|---|---|---|---|---|
| 1 | T8060 | TRIS 三羥甲基氨基甲烷 | 11 | S1051 | 4XSDS-PAGE分離膠緩沖液（PH=8.8） |
| 2 | G8200 | Glycine 甘氨酸 | 12 | S1052 | 4XSDS-PAGE濃縮膠緩沖液（PH=6.8） |
| 3 | S8010 | SDS 十二烷基硫酸鈉 | 13 | P1016 | 4×蛋白上樣緩沖液(含β-巰基乙醇) |
| 4 | A8080 | Acrylamide 丙烯酰胺 | 14 | P1015 | 4×蛋白上樣緩沖液(含DTT) |
| 5 | M8200 | N,N-Methylene Bisacrylamide甲叉雙丙烯酰胺 | 15 | D1070 | 1M DTT |
| 6 | A8090 | Ammonium Persulfate 過硫酸胺 | 16 | A1030 | 10%過硫酸氨 |
| 7 | D8220 | DTT 二硫蘇糖醇 | 17 | T1020 | 1M Tris-HCL (PH6.8) |
| 8 | M8210 | β-Mercaptoethanol β-巰基乙醇 | 18 | T1010 | 1.5M Tris-HCL(PH8.8) |
| 9 | T8090 | TEMED 四甲基乙二胺 | 19 | S1010 | 10%SDS |
| 10 | A1010 | 30%丙烯酰胺（29:1） | 20 | T1070 | 5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液 |
三、WESTERN BLOT
經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體(例如硝酸纖維素薄膜)上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分，此技術(shù)稱為免疫印跡（Western blot）。Western blotting檢測系統(tǒng)除需要過氧化物酶標(biāo)記的各種二抗外，還需要配套的顯色試劑。索萊寶提供DAB顯色和ECL化學(xué)發(fā)光兩種試劑及相應(yīng)試劑盒。
- 轉(zhuǎn)膜
- 顯色
Millipore和PALL公司的尼龍膜和pvdf膜，具有0.22um和0.45um兩種規(guī)格。 轉(zhuǎn)膜后還可以用P0012（10×麗春紅）檢測轉(zhuǎn)膜效果，尤其是針對NC膜效果更佳。 為了節(jié)省成本和時(shí)間，您可以選擇本公司的SW3020（Western Blot膜再生液）對用過的膜進(jìn)行清洗，隨后，可以使用不同的抗體進(jìn)行下一輪Western Blot實(shí)驗(yàn)。 膜再生液實(shí)質(zhì)是在不影響膜上結(jié)合的抗原的條件下將抗體洗脫下來，實(shí)際操作中，膜類型、抗體類型、濃度及抗原特性都影響洗脫難易度。 注意：適用于 ECL和類似的化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行的 Western 檢測。不適用于非化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行的 Western檢測，例如DAB，NBT/BCIP。
| 產(chǎn)品貨號(hào) | 產(chǎn)品名稱 |
|---|---|
| P0012 | 10×麗春紅 |
| SW3010 | 膜封閉液 |
| A1800 | 抗體稀釋液 |
| A1810 | 一抗稀釋液 |
| A1820 | HRP標(biāo)記抗體稀釋液 |
| A1830 | AP標(biāo)記抗體稀釋液 |
| A1840 | 熒光抗體稀釋液 |
| T1085 | 1×TBST |
實(shí)驗(yàn)操作過程中您可以針對不同的抗體選擇上面合適的稀釋液。